Pembuatan Media Agar PDA

Jumat, 23 Januari 2009

Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu media atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan media sebaiknya menggunakan air suling. Air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada media yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat (Hadioetomo, 1993).

Alat yang akan digunakan dalam suatu praktikum harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993).

Memformulasikan suatu media atau bahan yang akan digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di dalamnya harus memperhatikan berbagi macam ketentuan seperti jika yang ingin kita membuat media untuk organisme bersel tunggal, biasanya air sangat penting sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan media agar padat, digunakan agar-agar, gelatin atau gel silika. Bahan agar yang utama adalah galaktan (komplek karbohidrat yang diekstrak dari alga genus Gelidium). Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100^oC dan akan cair apabila kurang lebih 43^oC (Hadioetomo, 1993). Menurut Schlegel (1993) agar merupakan media tumbuh yang ideal yang diperkenalkan melalui metode bacteriaological.

Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Subtansi kimia organik dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrien diambil dari likungan kemudian ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler (Lim, 1998). Bakteri dalam media juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml media yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk dinding sel baru (Volk, 1993).

Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-40^oC (Volk, 1993).

PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan media sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan media mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Media didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa media masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan media yang steril juga menentukan (Dwidjoseputro, 1994).

Pembuatan media Potato Dextrose Agar (PDA), kentang sudah ditimbang dan direbus, dengan ukuran kentang 50,31 g dan agar 4,03 g. Disini menggunakan agar untuk mengentalkan media. Ekstrak kentang dan agar disetir dan diatur suhu dan pHnya. Sebelum dilakukan sterilisasi, media berawarna kuning, setelah disterilisasi dalam autoklaf media berwarna kecoklatan dan didapat endapan berwarna putih. Setelah didinginkan beberapa saat, media dapat ditanami bakteri (Schegel, 1993).

Pembuatan media Nutrien Agar (NA) menggunakan bahan utama beef ekstrak 5 g, peptom 3 g dan agar 3 g. Pada awal pengamatan media Nutrien Agar, sebelum proses sterilisasi berwarna kuning, setelah sterilisasi warna media menjadi agak coklat. Pada pembuatan media NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N₂ (Dwidjoseputro, 1994). Agar yang digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan media sama halnya dengan yang digunakan pada media PDA yang juga berperan sebagai media tumbuh yang ideal bagi mikroba (Schlegel, 1993). Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:

a.  Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170^o – 180^oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).

b.  Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).

c.  Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba) (Suriawiria, 2005).

Bahan yang dibutuhkan untuk membuat 0,5 liter media PDA (Potato Dekstrosa Agar), adalah:

·         Kentang yang telah dikupas kulitnya 100 gr

·         Dekstrosa (gula pasir) 10 gr

·         Agar-agar putih  10 gr

·         Aquades 500 ml

Sedangkan untuk alat yang digunakan dalam pembuatan meida PDA (Potato Dekstrosa Agar), adalah :

- Autoclave
- Timbangan
- Pisau
- Beaker Glass
- Gelas Ukur
- Erlenmeyer
- Alumunium Foil
- Saringan
- Kapas
- Kompor

Langkah Kerja

1. Kupas kentang, timbang seberat 100 gr kemudian dicuci bersih, baru dipotong kecil-kecil dengan ukuran kubus (dadu)
2. Rebus akuades 100 ml, setelah mendidih, baru kentang direbus hingga empuk (direbus selama 15-10 menit  setelah air mendidih), kemudian saring air rebusan kentang! (perebusan akan mengakibatkan volume aquades berkurang). Air rebusan kentang dimasukkan ke dalam gelas ukur.
3. Larutkan 10 gr dekstrosa dalam 100 ml akuades, lalu campurkan dengan air rebusan kentang, lalu tambahkan aquades hingga volumenya mencapai 0,5  liter!.
4. Masak lagi larutan rebusan kentang diatas kompor, kemudian masukkan 10 gr agar-agar sedikit-sedikit sambil diaduk sampai larut, dan setelah mendidih diangkat (catatan : jangan memasukkan agar-agar setelah air mendidih karena agar-agar akan menggumpal)
5. Saring kembali larutan tersebut dan tuangkan ke dalam erlenmeyer!.
6. Tutup erlenmeyer dengan kapas dan alumunium foil!.
7. Sterilkan media dalam erlenmeyer tersebut dengan menggunakan autoclave

Sterilisasi Dengan Autoclave

1. Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat gelas dan media PDA
2. Sebelum disterilkan, alat-alat gelas harus dicuci bersih dengan sabun untuk menghilangkan kotoran yang menempel, lalu dibilas air bersih. Setelah dicuci kemudian dikering anginkan di bawah sinar matahari. Alat-alat gelas yang tahan terhadap tekanan dan suhu tinggi (contoh gelas pyrex) dapat disterilkan dengan autoclave. Alat-alat gelas semacam botol, tabung reaksi, dan pipet lubangnya perlu disumbat dengan kapas, sedangkan untuk cawan petri dibungkus dengan kertas.
3. Sterilisasi dengan autoclave dilakukan pada suhu ± 121 ^oC tekanan 15 psi (1 atm)
4. Autoclave harus ditutup rapat.  Setelah suhu dan tekanan naik hingga mencapai tekanan 15 psi, maka tekanan dipertahankan/distabilkan selama 30 menit dengan mengatur tombol pengatur suhu, atau mengatur klep (membuka klep jika tekanan melewati angka 15 psi)
5. Selanjutnya autoclave bisa dibuka setelah suhu dan tekanan mencapai suhu dan tekanan awal (suhu 0⁰C dan tekanan 0 psi)